大鼠气道上皮细胞培养

1. 实验材料：wistar大鼠
2. 培养基：
基础培养基：DMEM/F12
添加因子：
3. 消化用液
成分：collagenase Ⅰ +  trypsin
时间：20min
温度：37℃
4. 实验步骤：
① 大鼠表面喷75%的酒精消毒，整个解剖板上下两面也喷75%酒精杀菌。（自己穿实验服，戴口罩，带乳胶手套，手每次进操作台前喷75%酒精）
② 拿入无菌操作台进行解剖，从器械盒取出剪刀、镊子各两把放入干净的培养皿中。解剖时，器械均过火灭菌。用镊子夹起老鼠胸骨柄下缘皮肤，剪刀横向剪开一开口，然后纵向向前剪至下颚下方，用大头针将皮肤固定。
③ 剪刀镊子分别用酒精棉球擦拭后过火，放入另一平皿中。用酒精棉球擦拭已剥离皮肤的部分。
④ 剪刀剪开皮下组织和肋骨，用镊子夹住气道上端进行分离，直至取到支气管上端，用剪刀剪断，放入含有无菌PBS液的培养皿中，分离粘连在气道上的其他成分。（尽量避免剪断食道，以防污染）
⑤ 用无菌的PBS清洗干净（约3-5遍），每一次均用新的无菌的培养皿。
⑥ 将洗过的气道转移至2mlEP管，加入些许PBS，用剪刀将组织剪碎，大约为1×1mm3的碎片。
⑦ 将剪碎的组织转移至15ml的离心管中，加入10ml左右的PBS清洗，弃上清，大约3次，上清干净不再浑浊。
⑧ 组织碎片用0.2% collagenase Ⅰ + 0.1% trypsin消化15min左右。消化是在15ml离心管中，4-5ml的消化混合液，37℃培养箱中消化。消化完后，显微镜观察细胞量。
⑨加入2ml含血清的培养基终止消化，200目筛过滤，收集上清。
⑩ 1000rpm离心5min，弃上清。加入3ml培养基混匀转移至25ml方瓶。放入37℃、5%CO₂ 培养箱培养。