小鼠原代肝细胞分离培养SOP

小鼠品系：不限
小鼠日龄：6周龄以上适合两步灌流法，6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法：
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射，待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上，于超净台中解剖，暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定，灌流前灌流液20ml，流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀，剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后，灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml，3-5ml/min。
4.取下肝脏，使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏，加入20ml基础培养基，轻轻吹打，先后过滤80目、200目细胞筛，收集滤液，600rpm，离心5min。
5.收集沉淀，加入20ml基础培养基重悬细胞，600rpm，离心5min。
6.收集沉淀，加入适量完全培养基+10%FBS重悬细胞，台盼蓝染色计数，以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液，使用完全培养基+5%FBS培养细胞，隔天换液。
组织块剪碎法：
1.断头处死成年小鼠，充分放血后迅速无菌取出肝脏组织，置于缓冲液中；
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块，使用缓冲液洗涤2-3遍，然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块，使用缓冲液冲洗直至上清澄清；
3.组织块转移至50ml离心管内，加入10ml消化液，37%，静置消化1h，间隔15min摇动1次；
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次，消化物分别过80目、200目细胞筛，收集滤液；
5.1000rpm，室温离心8min，收集细胞，使用基础培养基重悬细胞；
6.600rpm，离心5min，重复离心纯化2次，细胞经台盼蓝染色，计数，按1x106/25cm2的细胞数分瓶，使用完全培养基+20%FBS进行培养。
7.18h后换液，以后每天换液。
试剂配方：
前灌流液：
含0.02%EDTA，50U/ml肝素钠的无Ca2+，Mg2+的HBSS
缓冲液：
含Ca2+，Mg2+的HBSS
后灌流液：
含0.1%Ⅳ型胶原酶的HBSS（含Ca2+，Mg2+）
基础培养基：
高糖DMEM+10%FBS