小鼠内皮祖细胞

试剂和材料
成年大鼠 、血清、Ficoll、M199基础培养基
 
实验步骤
1.小鼠腹腔注射0.5ml 3%的麻醉致死 ，浸入盛有体积分数75%乙醇的烧怀中消毒15min后移出；
2.无菌条件下取出股骨、胫骨，去除干净附着于骨表面的肌肉。
3.将获取的骨头浸入盛有磷酸盐缓冲液PBS的小烧怀中，用剪刀剪去骨头两端的干骺端，暴露出骨髓腔。
4.取一支10ml一次性注射器抽取6~8ml的M199不完全培养液冲洗骨髓腔数次，至骨头发白透亮，收集细胞悬液。
5.取小鼠淋巴细胞分离液4ml加入12ml的离心管中，倾斜45度，再缓缓将细胞悬液加于淋巴细胞分离液之上，使其体积比为1：2，注意保持两者之间的界面清晰，勿使其彼此混合。
6.将离心管配平后放于离心机中，离心半径12cm，2000r/min，离心20min；
7.缓缓取出离心管，可看到离心管内的液体分为4层，最下层为红细胞与粒细胞，中间层为淋巴细胞分离液，最上层为血浆与M199培养基，在中间层与最上层之间有一层薄薄的云雾状层；
8.以移液器直插入云雾状层，缓缓抽吸；
9.将抽取的液体转移入另一离心管中，然后加入10ml PBS缓冲液，吹打均匀，离心，离心半径12cm，1500r/min，离心5min；
10.吸弃上清液，取10ml PBS缓冲液，吹打均匀，离心，离心半径12cm，1500r/min，离心5min。
11.吸弃上清液，加入5ml M199完全培养基，将细胞沉淀吹打均匀，接种于T25细胞培养瓶中，放入CO2培养箱培养